Analysen foregår ved måling af den mængde af lys, der går igennem et stof, når det udsættes for en belysning, der har en specifik bølgelængde.
Sådanne målinger kan kun foretages på opløsninger, der indeholder enten molekyler eller ioner, da disse typer opløsning i et eller andet omfang vil optage lys i en bestemt bølgelængde - en bølgelængde der naturligvis kan variere fra stof til stof.
Sådan foretages spektrofotometriske målinger
Til spektrofotometriske analyser anvendes et såkaldt spektrofotometer. Et spektrofotometer bruges til at sende lys gennem stoffet med en bestemt bølgelængde. Der findes flere forskellige spektrofotometre, som hver især kan udsende forskellige bølgelængder - lige fra UV-lys, og det lys, der er synligt for os til infrarødt lys. Det er derfor vigtigt at være opmærksom på, at man har det rette spektrofotometer til rådighed, før man går i gang med at foretage målingerne.
Den opløsning, der skal undersøges, kommes i en såkaldt kuvette. På den ene side af kuvetten placeres en fotocelle, som skal registrere, hvor meget lys, der bliver sendt igennem kuvetten. På den anden side af kuvetten placeres spektrofotometret, som skal sende lys gennem kuvetten.
Opbygningen af et spektrofotometer er således, at en lampe i fotometeret udsender lys. Lyset fra lampen sendes gennem et gitter, hvorved der opstår en bestemt bølgelængde. Lyset vil derefter ramme kuvetten med en den samme bølgelængde, gå igennem kuvetten og ramme fotocellen på den anden side af kuvetten. Fotocellen opfanger nu, hvor meget af lyset med den specifikke bølgelængde, der sendes gennem kuvetten og dermed gennem stoffet i kuvetten.
Inden man foretager en spektrofotometrisk måling af en kemisk opløsning, er det vigtigt at være opmærksom på, at lyset ikke kun vil blive optaget af molekylerne eller de ion-opløsninger, der måtte være, men også optages af det opløsningsmiddel, der anvendes. Det vil derfor være nødvendigt at kalibrere spektrofotometret med opløsningsmidlet, inden undersøgelsen påbegyndes. Dette gøres ved at fylde en kuvette med opløsningsmidlet og gennemlyse dette med spektrometret, hvorefter tallene skal bruges til udregning, når opløsningen er blevet gennemlyst. Udregningen foretages ved brug af Lambert-Beers lov.
Med spektrofotometri er det blandt andet muligt at bestemme koncentrationen af stoffer i en kemisk opløsning, absorptionsspektret i en kemisk opløsning samt koncentrationen af molekyler og ioner.
